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定點敲入小(大)鼠

技術(shù)原理簡介

基因敲入(Knockin)鼠是指通過TALEN/CRISPR技術(shù)在目的序列位置引進(jìn)特定的突變或外源基因的小鼠。通過針對基因靶序列設(shè)計相應(yīng)的打靶質(zhì)粒,然后根據(jù)需要插入的位置構(gòu)建含Knockin片段或點突變的Donor質(zhì)粒,將Donor質(zhì)粒與打靶質(zhì)粒共同顯微注射進(jìn)小鼠的受精卵中,TALEN/CRISPR定位到基因組上的靶序列并切割雙鏈DNA,在隨后的修復(fù)過程中,細(xì)胞以含同源序列的Donor質(zhì)粒為模版修復(fù)基因組DNA,最終獲得在目的DNA序列插入Knockin片段的Knockin小鼠。比如將報告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等)通過同源重組的方式引入目的基因的特定位點,從而跟蹤目標(biāo)基因的表達(dá);也可以用報告基因取代大小鼠本身的基因,即:KO/KI同時發(fā)生。

TALEN/CRISPR構(gòu)建定點敲入小(大)鼠技術(shù)流程圖

服務(wù)流程及周期

服務(wù)流程及周期圖

步驟    內(nèi)容    周期
敲入元件獲得 客戶提供或全基因合成 根據(jù)實際情況而定
Cas9/gRNA的合成和同源模板(Donor)構(gòu)建  合成Cas9/gRNA,檢測Cas9/gRNA活性,構(gòu)建同源模板質(zhì)粒  2個月
得到Founder Cas9/gRNA體外轉(zhuǎn)錄成mRNA和Donor質(zhì)粒共同顯微注射受精卵,胚胎移植到代孕母鼠子宮,3周后出生,2周齡基因型鑒定。 2-3個月
得到F1代雜合子  2個月后性成熟,F(xiàn)ounder和野生型小鼠交配,3周后出生,2周齡基因型鑒定,獲得穩(wěn)定傳代的基因突變雜合子F1代。  3-4個月

 

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