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基于CRISPR/Cas9的高通量篩選

我們的策略是直接在功能上研究,通過gRNA敲除候選基因篩選得到功能基因。合成致死的靶基因,gRNA和藥物聯(lián)合使用可以篩選到能夠起耐藥作用的靶基因。這些數(shù)據(jù)為靶向治療和聯(lián)合用藥提供了重要依據(jù)?;趃RNA文庫的高通量篩選,可平行分析成千上萬條基因功能,大大加快研究進(jìn)程,從而能迅速、詳盡地鑒定出細(xì)胞過程或信號傳導(dǎo)途徑的相關(guān)基因,以及疾病相關(guān)的藥物靶基因,保證研究成果更為系統(tǒng)和新穎。

基于慢病毒策略的單細(xì)胞篩選技術(shù)

1.  oligo用芯片方式合成,成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)化學(xué)方式。

2.  gRNA片段構(gòu)建到慢病毒載體上,包裝成慢病毒混合文庫。

3.  通過控制病毒用量,盡量讓每個細(xì)胞被一個基因的一個靶點所作用。

4.  利用控制細(xì)胞存活,結(jié)合免疫染色、流式細(xì)胞術(shù)等手段得到篩選后的細(xì)胞。

5.  篩選得到的細(xì)胞使用通用引物PCR,二代測序分析,通過比對得到gRNA信息,從而推斷出起作用的靶基因。

成功案例

 已知藥物功能篩選其耐藥靶點

篩選策略:

1.   明確該藥物功能,明確該藥物的致死工作濃度。

2.  構(gòu)建Cas9-gRNA慢病毒文庫。侵染細(xì)胞,構(gòu)建整合Cas9-gRNA的細(xì)胞混合克隆。

3.  開展篩選工作:高濃度藥物短期內(nèi)持續(xù)作用細(xì)胞混合克隆,成活的細(xì)胞即為產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞,而產(chǎn)生耐藥性的原因是Cas9-gRNA導(dǎo)致的基因變異。

4.  存活的細(xì)胞通過二代測序,比對得到gRNA信息,從而推斷出起作用的基因靶點

成品文庫信息:

1.  人源CRISPR/Cas9-sgRNA慢病毒文庫:約21000個基因,每個基因?qū)?yīng)6條gRNA。

慢病毒毒液,-80度儲存。

詢價。

 

參考文獻(xiàn):

1.  ShalemO , Sanjana N E , Hartenian E , et al.Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells[J]. Science, 2014,343(6166):84-87.

 

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